Clonage de l'ADN

Qu'est-ce qu'un vecteur de clonage ADN ?

Les vecteurs sont des morceaux d'ADN dans lesquels on peut insérer d'autres morceaux d'ADN. Ce sont ces vecteurs qui vont permettre d'introduire l'ADN dans les cellules hôtes. Il existe différents vecteurs qui peuvent être utilisés, tels que les plasmides (provenant de bactéries), les vecteurs viraux (provenant de virus), les cosmides (un type de plasmide hybride) et les chromosomes artificiels (des chromosomes fabriqués par l'homme qui contiennent les caractéristiques souhaitées).

Objectif du clonage de l'ADN

Il y a de multiples raisons pour lesquelles les scientifiques veulent utiliser le clonage de l'ADN :

• Produire de grandes quantités d'ADN ou de protéines souhaitées.

• Créer de l'ADN recombinant pour étudier le fonctionnement des gènes.

• Étudier les mutations génétiques potentielles et la façon dont elles peuvent modifier la fonction d'un gène.

• Étudier les caractéristiques des gènes.

Le clonage de l'ADN peut également être utilisé dans le domaine médical ! Grâce à l'ADN recombinant, les protéines humaines souhaitées peuvent être données à des cellules bactériennes. Les cellules bactériennes deviennent capables de produire ces protéines qui peuvent être récoltées pour les médicaments humains ! L'insuline et les hormones de croissance humaines en sont deux exemples.

Les étapes du clonage de l'ADN

Pour cloner de l'ADN, il faut suivre un processus en plusieurs étapes. Les étapes du clonage de l'ADN sont les suivantes :

1. Isolement de l'ADN désiré

2. Ligature

3. Transformation

4. Procédure de sélection

Isolement de l'ADN souhaité

Pour pouvoir utiliser le gène ou l'ADN qui nous intéresse, il faut l'isoler du reste de l'ADN. La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est généralement utilisée pour créer plusieurs copies de l'ADN souhaité.

Ligature

Ensuite, l'ADN isolé et amplifié sera placé dans un vecteur afin de créer un ADN recombinant. Pour ce faire, il faut procéder à une ligature. La ligature est le processus qui consiste à joindre deux brins d'ADN différents.

Le vecteur doit être ouvert à l'aide d'enzymes de restriction afin d'accepter l'ADN d'intérêt. L'ADN d'intérêt utilise également les mêmes enzymes de restriction afin de s'assurer que ses extrémités seront complémentaires au vecteur ouvert. L'ADN ligase, une autre enzyme, sera utilisée pour attacher l'ADN d'intérêt au vecteur, ce qui créera la molécule d'ADN recombinant souhaitée.

Transformation

La molécule d'ADN recombinant est ensuite donnée à une cellule hôte, en général, on utilise des cellules bactériennes, notamment E. coli. Une longue procédure est effectuée pour s'assurer que les cellules hôtes absorbent l'ADN recombinant donné et sont capables de faire pousser des colonies contenant cet ADN désiré. Dans certains cas, ces colonies devront être maintenues toute la nuit dans un incubateur !

Pour s'assurer que seules les colonies souhaitées se développent, on utilise généralement des gènes de résistance aux antibiotiques. Par exemple, la molécule d'ADN recombinant peut comporter un gène de résistance à l'ampicilline, puis les cellules hôtes sont placées dans une boîte de Petri contenant un gel d'agar avec de l'ampicilline. Seules les cellules hôtes qui contiennent le gène de résistance à l'ampicilline pourront se développer sur la boîte de Petri, ce qui permet aux scientifiques de s'assurer que leur processus de transformation a réellement fonctionné.

Procédure de dépistage

Enfin, les colonies de la boîte de Petri devront être récoltées et vérifiées pour s'assurer qu'elles contiennent bien l'insert désiré. Généralement, on effectue à nouveau une PCR ou on a recours à l'analyse des fragments de restriction. L'analyse des fragments de restriction utilise des enzymes de restriction pour digérer l'ADN vectoriel isolé. Si l'ADN vectoriel isolé contient l'insert souhaité, les enzymes de restriction l'exciseront.

Après l'utilisation de la PCR ou de l'analyse des fragments de restriction, les résultats devront être vérifiés à l'aide d'une électrophorèse sur gel ou d'une analyse de la séquence d'ADN.

L'électrophorèse sur gel consiste à utiliser un gel, généralement à base d'agarose, et de l'électricité pour séparer l'ADN en fonction de sa taille et de sa charge. L'ADN est inséré dans de petits puits situés en haut du gel. Les charges négatives, le fil noir, se trouvent en haut du gel, et les charges positives, le fil rouge, se trouvent en bas. Comme l'ADN est chargé négativement, les charges négatives du haut poussent l'ADN vers le bas, vers le fond du gel chargé positivement. Plus la taille du fragment d'ADN est petite, plus il peut descendre loin dans le gel. L'ADN désiré est généralement évalué à l'aide d'une échelle d'ADN, c'est-à-dire des bandes d'ADN dont la valeur est connue. Les bandes d'ADN peuvent être mesurées en nucléotides (nt) ou en paires de bases (pb), qui sont égales entre elles. Tu peux voir un exemple d'électrophorèse sur gel ci-dessous dans la Fig. 3 avec l'échelle d'ADN à gauche avec ses valeurs connues et trois échantillons.

Figure 3. Exemple d'électrophorèse sur gel. Source : Mckenzielower via wizeprep.com

L'analyse des séquences d'ADN est une méthode qui permet d'évaluer la structure des nucléotides de l'ADN recombiné. Il existe différents types d'analyse de séquences d'ADN, et le type choisi dépend de la taille de l'ADN recombiné. Il existe deux principaux types d'analyse de séquences d'ADN:

• Leséquençage Sanger: Fonctionne pour l'ADN jusqu'à 900 pb, mais il est coûteux et inefficace pour tout ce qui est plus grand.

• Séquençage de nouvelle génération: Fonctionne pour l'ADN de 50 à 700 pb, mais il est plus rapide, moins cher et peut exécuter plusieurs séquences à la fois, contrairement au séquençage Sanger.

Quelles sont les méthodes de clonage et d'assemblage de l'ADN ?

Il existe plusieurs façons de cloner l'ADN :

• Clonage basé sur les enzymes de restriction: Utilise des enzymes de restriction pour couper le fragment d'ADN qui t'intéresse et le vecteur, puis utilise l'ADN ligase pour placer le fragment d'ADN dans le vecteur.

• Clonagepar PCR: Utilise l'ADN ligase pour placer les fragments d'ADN amplifiés dans le vecteur. Un vecteur spécifique à "queue de T" est nécessaire pour ce processus, ce qui signifie que les extrémités du vecteur doivent toutes deux être constituées du nucléotide thymine.

• Clonage indépendant de la ligature: Des séquences correspondantes seront trouvées à la fois sur l'ADN d'intérêt et sur le vecteur, et des enzymes seront utilisées pour créer les extrémités de l'ADN d'intérêt et du vecteur insérés, de sorte que l'étape de recuit permettra aux extrémités de se fermer et de créer la molécule d'ADN recombinant.

• Clonage sans couture: Similaire au clonage indépendant de la ligature, il a besoin d'une enzyme pour créer les extrémités de l'ADN d'intérêt et du vecteur, mais il a besoin de l'ADN polymérase pour combler les lacunes de l'ADN d'intérêt inséré et du vecteur et de l'ADN ligase pour s'assurer que la molécule d'ADN recombinant a été correctement créée.

• Clonage recombinatoire: Processus en plusieurs étapes qui utilise un vecteur d'entrée et des enzymes recombinases de l'ADN. L'ADN d'intérêt est placé dans le vecteur d'entrée. Le vecteur d'entrée est ensuite combiné au vecteur de destination pour former ce qu'on appelle un clone de destination à l'aide de l'ADN recombinase.

Techniques de clonage de l'ADN

Il existe différents conseils et astuces pour garantir l'efficacité du clonage de l'ADN. Par exemple, il est essentiel de s'assurer que l'ADN ne comporte pas de contaminants susceptibles de réduire les résultats finaux du clonage. Les contaminants de l'ADN peuvent être éliminés en utilisant des kits de purification. Lorsque l'on effectue des réactions à base d'enzymes de restriction, il est important de savoir qu'il ne faut pas ajouter trop d'enzymes de restriction. Le volume d'enzymes de restriction ne doit pas dépasser 10 % par rapport au volume total. De plus, utilise des méthodes de mesure quantitative pour évaluer si la quantité de matériel qui sera utilisée pour les réactions en aval est adéquate ou non.