Loi de Beer-Lambert

Lumière monochromatique

La lumière est la source fondamentale d'énergie sur Terre. La lumière est de différentes longueurs d'onde classées en fonction de ses propriétés et de son comportement. La lumière présente diverses propriétés comme la diffraction, la réflexion, la réfraction, la polarisation et l'interférence. Les radiations électromagnétiques se composent de différentes longueurs d'onde de la lumière.

La lumière visible d'une bande étroite de longueurs d'onde est classée parmi les lumières monochromatiques. Elle se caractérise par une longueur d'onde comprise dans une gamme étroite de longueurs d'onde. Ces lumières se distinguent par leur intensité ou leur luminosité, leur couleur, leur direction de propagation et leur état de polarisation.

Spectrophotométrie

La spectrophotométrie est une méthode permettant de déterminer combien une substance chimique absorbe la lumière en mesurant l'intensité de la lumière lorsqu'un faisceau lumineux traverse une solution échantillon. Le principe de base est que chaque composé absorbe ou transmet la lumière sur une certaine plage de longueur d'onde. Cette mesure peut également être utilisée pour mesurer la quantité d'une substance chimique connue. La spectrophotométrie est l'une des méthodes d'analyse quantitative les plus utiles dans divers domaines tels que la chimie, la physique, la biochimie, le génie chimique et des matériaux et les applications cliniques.¹

Spectroscopie ultraviolet-visible

La spectroscopie ultraviolet-visible ou spectrophotométrie ultraviolet-visible \( (UV-Vis) \) fait référence à la spectroscopie d'absorption ou de réflectance dans la région spectrale ultraviolet-visible.

Spectroscopie UV-Vis : Théorie

Lorsque l'interaction entre le rayonnement incident et le nuage d'électrons d'un chromophore entraîne une transition électronique impliquant la transition d'un ou plusieurs électrons de la couche externe ou de liaison d'un état fondamental à un état d'énergie plus élevé, on obtient des spectres ultraviolet-visible \( (UV-Vis) \) .

Qu'est ce que l'absorbance ?

L'absorbance d'un échantillon est une mesure de la quantité de lumière absorbée par un échantillon lorsqu'elle passe à travers celui-ci.

Absorbance : Formule de Beer-Lambert

On suppose que l'absorbance due à l'échantillon a les propriétés suivantes :

• L'absorbance de l'échantillon, \( Abs \) , est directement proportionnelle à la longueur du trajet lumineux, \( l \) , à travers la cuvette.

• L'absorbance de l'échantillon, \( Abs \) , est directement proportionnelle à la concentration du soluté, \( c \) .

En symboles :

$$ Abs \ \alpha \ l \ \alpha \ c.l $$

Cette relation de proportionnalité peut être convertie en une équation en incluant une constante de proportionnalité, que nous appellerons le coefficient d'absorption molaire, \( \varepsilon \) , ce qui nous donne une équation pour l'absorbance :

$$ Abs= \varepsilon .c.l $$

Coefficient d'absorption molaire : Espèce chimique

Le coefficient d'absorption molaire est également connu sous le nom de coefficient d'extinction molaire ou d'absorptivité molaire.

Équation d'absorbance ne peut être utilisée que si le coefficient d'extinction molaire, \( \varepsilon \) , est connu. En mettant tout cela ensemble, on obtient l'équation de la loi de Beer-Lambert, qui relie l'atténuation, ou la diminution de l'intensité lumineuse causée par l'échantillon, au produit de la concentration du soluté, \( c \) , et de la longueur du trajet, \( l \) , à travers la cuvette :

$$ Abs= log_{10} \left ( \frac{I_0}{I} \right ) = \varepsilon .c.l $$

Loi de Beer-Lambert : Spectrophotomètre

• Lorsqu'un faisceau lumineux d'un spectrophotomètre passe à travers une solution active dans l'ultraviolet, l'intensité du faisceau lumineux diminue.

• La diminution de l'intensité du faisceau lumineux lors de son passage à travers une solution est également appelée atténuation.

• Lorsque l'échantillon absorbe la lumière du spectrophotomètre traversant un échantillon, on parle d'absorbance de l'échantillon.

• La loi de Beer-Lambert relie la diminution de l'intensité du faisceau lumineux du spectrophotomètre lorsqu'il traverse un échantillon à l'absorbance de l'échantillon.

• En outre, l'absorbance de l'échantillon est prise en compte en éliminant l'absorbance due au solvant, comme nous l'expliquerons plus loin.

L'intensité de la lumière traversant la cellule de référence (constituée uniquement du solvant), symbolisée par \( I_0 \) , est mesurée à chaque longueur d'onde, \( λnm \) , dans la gamme de longueurs d'onde du spectromètre \( UV-Vis \) .

Fig. 1- Configuration de l'expérience UV-vis pour la cellule de référence.

À son tour, l'intensité de la lumière traversant la cellule d'échantillon (solvant plus soluté), symbolisée par \( I \) , est également mesurée à chaque longueur d'onde, \( λnm \) , dans la gamme de longueurs d'onde du spectrophotomètre.

Fig. 2- Configuration de l'expérience UV-vis pour la cellule d'échantillon.

La lumière se propage à travers chaque cellule sur le détecteur du spectrophotomètre. Les spectrogrammes résultants de l'intensité lumineuse par longueur d'onde sont ensuite traités et combinés pour donner un graphe de la loi de Beer-Lambert, comme nous le verrons plus en détail ci-dessous. Si, pour une longueur d'onde donnée, l'intensité lumineuse traversant la cellule échantillon, \( I \) , est inférieure à l'intensité lumineuse traversant la cellule de référence, \( I_0 \) , alors l'échantillon a absorbé la lumière à cette longueur d'onde.

Loi de Beer-Lambert : Spectre

Nous utilisons le rapport, \( \frac{I_0}{I} \) , pour calculer l'absorbance due à l'échantillon à l'aide de la formule d'absorbance suivante :

$$ Abs= log_{10} \left ( \frac{I_0}{I} \right ) $$

La formule d'absorbance prend en compte l'atténuation de la lumière due à l'absorption de la lumière par le soluté par rapport à l'absorption par le solvant. Aux longueurs d'onde d'intérêt, dans lesquelles le solvant n'absorbe pas sensiblement la lumière \( UV-vis \) mais le soluté absorbe fortement la lumière, le rapport d'intensité, \( \frac{I_0}{I} \) , sera un nombre supérieur à un. C'est-à-dire qu'une plus grande quantité de lumière \( I_0 \) atteint le détecteur lorsqu'elle traverse la cellule de référence, ce qui donne une valeur élevée par rapport à la lumière qui atteint le détecteur à partir de la cellule de l'échantillon, et donne une valeur plus faible pour l'intensité lumineuse, \( I \) , parce que l'échantillon a absorbé la lumière qui aurait autrement atteint le détecteur. Le tracé de l'absorbance, \( Abs \) , en fonction de la longueur d'onde, le graphe de Beer-Lambert, donne des pics positifs d'absorbance de l'échantillon à des longueurs d'onde intéressantes, à savoir lorsque le rapport, \( \frac{I_0}{I} \) , est supérieur à un, : \( \frac{I_0}{I} > 1 \) .

\( Abs_{Longueur \ d'onde} =log_{10} \left ( \frac{I_0}{I} \right ) \)

Fig. 3- Graphe de Beer-Lambert.

Unités de la loi de Beer-Lambert

Nous notons également que les unités de la loi de Beer-Lambert pour la concentration, \( c \) , sont généralement données en moles par litre \( (mol/L) \) et que la longueur du trajet de la cuvette est de l'ordre du centimètre \( (cm) \) . Par conséquent, les dimensions du coefficient d'absorption molaire, \( \varepsilon \) , sont généralement exprimées en \( L. mol^{-1} . cm^{-1} \). En outre, il convient de noter que l'absorbance, \( Abs \) , est une quantité sans dimension, de sorte qu'une absorbance est un nombre supérieur à zéro pour les pics d'intérêt.

Loi de Beer-Lambert : Exemple

Considérons l'exemple suivant de la loi de Beer-Lambert.

Une solution d'une enzyme d'intérêt a été préparée dans un tampon à base d'eau. Le chimiste aimerait savoir comment calculer l'activité enzymatique à l'aide de la loi de Beer-Lambert. Nous avons noté précédemment que la loi de Beer-Lambert est utilisée en spectroscopie UV-Vis pour détecter un soluté actif dans l'UV-Vis dans la solution de l'échantillon.

Ainsi, un métabolite actif dans l'UV-Vis doit être produit par l'activité de l'enzyme, c'est-à-dire que le métabolite doit avoir une absorbance dans la gamme \( 200nm-800nm \) . L'exigence de la présence d'un soluté actif dans l'UV-Vis dans une solution d'échantillon est une exigence de la spectroscopie UV-vis. En ce qui concerne la loi de Beer-Lambert, une autre limitation est que les forces intermoléculaires entre le soluté et le solvant peuvent changer lorsque la concentration du soluté change, et ces changements dans le type de forces intermoléculaires soluté/solvant peuvent affecter le graphe de la loi de Beer-Lambert d'une manière qui n'est pas linéaire.

Pour en revenir à l'expérience, le chimiste transfère ensuite la solution d'enzyme tamponnée dans une cuvette en quartz ; c'est ce que nous appellerons la cellule de référence, qui est placée dans la fente de la cellule de référence du spectrophotomètre. Ensuite, une autre portion de la solution d'enzyme tamponnée est transférée dans une autre cuvette en quartz, et un composé qui est métabolisé par l'enzyme est ajouté et le tout est immédiatement placé dans la fente de la cellule d'échantillon. Les absorbances, \( Abs \) , des deux cuves sont relevées par incréments jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de changement dans l'absorbance du métabolite. La concentration de la solution d'échantillon, \( c \) , à chaque point de temps est alors déterminée par l'équation de la loi de Beer lambert sous la forme suivante :

$$ c= \frac{Abs}{ \varepsilon .l} $$

Il s'agit d'une autre forme de l'équation de Beer-Lambert utilisée pour calculer la concentration de soluté (métabolite), \( c \) , dans un échantillon ; où \( \varepsilon \) , est le coefficient d'extinction molaire du métabolite dans la solution de l'échantillon et \( l \) , est la longueur du trajet de la cuvette.

Les points de données calculés de la concentration du métabolite, \( c \) , sont ensuite tracés en fonction du temps. Une courbe est ensuite ajustée aux points de données dispersés. La pente d'une région dans laquelle la courbe ajustée est linéaire est ensuite déterminée. Cette valeur de la pente d'une région linéaire de la courbe ajustée est l'activité enzymatique.

Loi de Beer-Lambert : Limites

Nous abordons ici certaines des limites de la loi de Beer-Lambert. La première et principale limite est qu'un soluté actif dans l'UV-vis doit être présent dans la solution de l'échantillon pour qu'un signal de détection soit généré par un spectrophotomètre UV-vis.

Forces intermoléculaires

Il faut garder à l'esprit que les forces intermoléculaires entre le soluté et le solvant peuvent changer lorsque la concentration du soluté change et que ces changements dans les interactions intermoléculaires soluté/solvant peuvent affecter le graphe de la loi de Beer Lambert d'une manière qui n'est pas linéaire. Par conséquent, il est important de choisir une longueur d'onde, \( λnm \) , dans le graphe de la loi de Beer Lambert qui affiche une réponse linéaire proportionnelle aux changements de la concentration du soluté. En d'autres termes, les longueurs d'onde intéressantes présentent une réponse linéaire proportionnelle aux changements de la concentration de soluté.

Limitations instrumentales

La loi de Beer-Lambert est strictement respectée lorsqu'il existe une source de rayonnement monochromatique. En pratique, cependant, il est courant d'utiliser une source de rayonnement polychromatique avec une distribution continue de longueurs d'onde, ainsi qu'un filtre ou un réseau de monochromateurs pour créer un faisceau monochromatique à partir de cette source.